以下是賽默飛熒光定量PCR儀（以QuantStudio 5為例）的操作指南，包括詳細步驟、實用技巧以及使用過程中的注意事項，旨在幫助用戶規(guī)范使用流程，提升實驗效率與數據準確性。

一、實驗準備階段

1. 儀器檢查

• 打開設備電源，檢查是否正常啟動；

• 查看觸摸屏界面是否響應靈敏；

• 確認儀器運行環(huán)境清潔，通風良好；

• 檢查樣品槽與加熱蓋是否干凈、無異物。

2. 耗材準備

• 使用推薦的96孔PCR板、光學封板膜或8聯管；

• 檢查耗材是否變形、污染；

• 使用匹配的熒光探針或染料（如SYBR Green、TaqMan探針等）。

二、實驗步驟

步驟一：反應體系配置

配置原則：

• 所有反應體系在冰上操作，避免酶失活；

• 設置陰性對照（NTC）和陽性對照，確保結果可靠。

常見反應體系（20μL）示例：

步驟二：樣本加載

• 使用多道移液器將反應體系均勻分裝到PCR板中；

• 避免氣泡產生，可輕輕離心板子消除氣泡；

• 使用光學封板膜密封，確保密封性和光學透明性；

• 標記板子邊角，便于后續(xù)在軟件中定位樣本孔。

步驟三：加載PCR板并設置程序

1. 打開儀器上蓋，將樣品放入樣品槽中；

2. 合上上蓋（帶加熱蓋）；

3. 在QuantStudio軟件中：

   mathematica復制代碼初始變性：95°C，2分鐘  PCR循環(huán)：95°C 15秒 → 60°C 1分鐘，40個循環(huán)  （如需熔解曲線，添加最后一步）

• 選擇實驗模板（絕對定量/相對定量/熔解曲線分析等）；

• 輸入樣品信息（樣品名、通道、探針染料等）；

• 設置擴增程序，例如：

4. 點擊“Start Run"啟動實驗。

三、實驗后數據處理

1. 實時監(jiān)控

實驗過程中可實時查看熒光曲線；確認每個樣本擴增是否符合預期（有無拖尾、遲滯、漂移等異常）。

2. 數據分析

• 完成后，使用軟件自動分析Ct值；

• 可進行標準曲線構建、表達量分析（ΔCt、ΔΔCt）等；

• 導出數據為Excel、PDF、圖像等格式用于報告或發(fā)表。

四、實用技巧

五、注意事項

操作方面

• 所有試劑應現配現用，并于冰上操作；

• 每次使用前檢查儀器光學系統及樣本槽是否干凈；

• 加熱蓋溫度建議比退火/延伸溫度高5°C，以防蒸發(fā)。

軟件使用

• 正確設置每個孔的熒光染料通道和樣本分組；

• 使用模板保存實驗設置，減少重復錄入；

• 實驗結束及時保存原始文件以備追蹤。

儀器維護

• 每月用無塵布或酒精棉清潔儀器表面；

• 避免將液體灑入儀器內部；

• 定期校準溫控和光學模塊（可聯系廠家技術服務）。

六、小結

賽默飛QuantStudio 5熒光定量PCR儀憑借穩(wěn)定的性能和便捷的操作，在各類分子生物實驗中發(fā)揮了重要作用。通過規(guī)范的操作流程、優(yōu)化的實驗設置和細致的維護管理，用戶可以獲得準確、穩(wěn)定、重復性良好的檢測結果。掌握操作技巧和注意事項，不僅能提升實驗效率，也有助于減少實驗失敗和數據偏差。對于長期開展qPCR實驗的實驗室，建立標準操作流程（SOP）尤為重要。